近日,，我校生命科學(xué)學(xué)院胡宇飛課題組在Plant Journal上發(fā)表題為“Efficient targeted T-DNA integration for gene activation and male germline-specific gene tagging in Arabidopsis”的研究論文,，該研究在擬南芥中實(shí)現(xiàn)高效T-DNA的定點(diǎn)插入，并開(kāi)發(fā)了相關(guān)應(yīng)用,。

  位點(diǎn)特異性DNA插入（site-specific DNA insertion）是作物育種和基因功能分析的重要工具,，可以將功能性元件插入特定基因組位點(diǎn),，并可以避免插入基因在染色體不同位置所帶來(lái)的表達(dá)差異。傳統(tǒng)的位點(diǎn)特異性DNA插入方法基于同源重組修復(fù)（homology-directed repair,，HDR）機(jī)制,，然而，植物細(xì)胞中HDR的低活性使得需要多個(gè)世代,，篩選大量后代,，因而效率低下。與HDR介導(dǎo)的插入低效相比,，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA整合效率高,，是植物遺傳工程的主要手段。然而,，T-DNA整合依賴(lài)非同源末端連接（non-homology end joining, NHEJ）途徑,，在植物基因組中的插入位點(diǎn)具有隨機(jī)性,。

  該研究開(kāi)發(fā)了一種CRISPR/Cas9介導(dǎo)的擬南芥靶向T-DNA插入的方法，該方法比HDR介導(dǎo)的方法更快速,、高效,，并以此開(kāi)發(fā)了基因激活和雄性生殖細(xì)胞特異性基因標(biāo)記兩種應(yīng)用?；蚣せ钔ㄟ^(guò)在T-DNA的LB端設(shè)置CaMV35S啟動(dòng)子,，定點(diǎn)插入激活特定的下游基因。利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了FT和MYB26的激活,，顯著增加了轉(zhuǎn)錄表達(dá),，分別導(dǎo)致早花和花藥內(nèi)壁次生壁增厚模式的改變。雄性生殖細(xì)胞特異性基因標(biāo)記的T-DNA中包含兩個(gè)報(bào)告基因,，即NeoR和MGH3::mCherry，有助于創(chuàng)建定點(diǎn)插入突變體,，簡(jiǎn)化突變等位基因的遺傳分析,，并可對(duì)受精過(guò)程的生殖細(xì)胞進(jìn)行活體追蹤。該研究成功地將該系統(tǒng)應(yīng)用于靶向精細(xì)胞特異表達(dá),，參與精卵識(shí)別的基因GEX2,。

圖1. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的T-DNA定點(diǎn)插入

　　生命科學(xué)學(xué)院碩士研究生許鵬和分析測(cè)試中心黃吉雷高級(jí)實(shí)驗(yàn)師為論文共同第一作者。生命科學(xué)學(xué)院胡宇飛副教授為論文通訊作者,。莊楚雄教授對(duì)論文有貢獻(xiàn),。研究得到國(guó)家自然科學(xué)重點(diǎn)基金，廣東省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的支持,。

  相關(guān)論文鏈接：http://dx.doi.org/10.1111/tpj.70104 

文圖/生命科學(xué)學(xué)院胡宇飛