近日,，我校生命科學學院、亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室,、嶺南現代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室劉耀光院士/祝欽瀧研究員團隊在國際著名學術期刊Plant Biotechnology Journal（IF2020=9.803,，生物學一區(qū)）在線發(fā)表了題為“PhieABEs: a PAM-less/free high-efficiency adenine base editor toolbox with wide target scope in plants”的研究論文（論文鏈接地址：https://doi.org/10.1111/pbi.13774）,。該研究利用高活性腺嘌呤脫氨酶,、單鏈DNA結合結構域（DBD）與廣靶向的SpCas9變體,，成功開發(fā)了一套幾乎無PAM限制的高效廣靶向植物腺嘌呤堿基編輯器PhieABEs （plant high-efficiency ABEs）,，為植物功能基因組研究和作物遺傳改良提供了實用的工具,，并對其他編輯系統(tǒng)的改良具有參考意義,。
通過將腺嘌呤或胞嘧啶脫氨酶與Cas9缺刻酶（Cas9n）融合而成的腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）和胞嘧啶堿基編輯器（CBEs）能在不需要供體模板且不產生DNA雙鏈斷裂的條件下分別實現A-G（T-C）或C-T（G-A）的堿基替換。但是目前廣泛使用的ABE7.10系統(tǒng)在植物中的編輯效率很低（平均約為0-11.9%）,，而最近的研究中報道了基于新型腺嘌呤脫氨酶TadA8e開發(fā)的ABE8e系統(tǒng)在一定程度上提高了植物單堿基編輯效率,，但仍缺乏在多個代表性靶點中對其穩(wěn)定性和靶序列偏好性進行系統(tǒng)分析。另一方面,，目前大多數堿基編輯系統(tǒng)使用識別NGG-PAM的SpCas9n變體,，其嚴重限制了基因組靶點的選擇自由度。因此,，開發(fā)更加高效,、廣靶向的植物ABE系統(tǒng)，對促進功能基因組研究,、加快農作物遺傳改良進程具有重要作用與現實意義,。
此外，來自人源Rad51蛋白非序列特異性的ssDNA結合結構域（DBD）,，對解旋后的DNA單鏈具有穩(wěn)定作用,，但其與植物ABE系統(tǒng)的兼容性如何，以及能否提高堿基編輯系統(tǒng)的活性并擴增編輯窗口,，均是未知的,。
劉耀光院士/祝欽瀧研究員團隊根據水稻密碼子偏好性重新優(yōu)化TadA8e、DBD的核苷酸序列,，并將它們分別與兩種識別NGN-PAM（PAM-less）的SpCas9n變體編碼基因SpCas9n-NG和SpGn,，以及一種識別NNN-PAM（PAM-free）的SpCas9n變體編碼基因SpRYn融合,，開發(fā)了一套植物腺嘌呤單堿基編輯器PhieABEs（hyABE8e-NG、hyABE8e-SpG和hyABE8e-SpRY）,，并在29個水稻基因組靶點（含有NGN-PAM或NHN-PAM,，其中H為A，T或C）中測試分析了上述系統(tǒng)的編輯效率等特性,。結果顯示,，在17個測試的NGN-PAM靶點中，PhieABEs的平均編輯效率為67.8%–78.5%,，編輯窗口為A1–A14,，相較于ABE7.10（平均效率為2.6%，編輯窗口為A4–A8）和普通ABE8e系統(tǒng)（平均效率為46.7%–59.7%,，編輯窗口為A3–A14）均有顯著的提高和擴展，特別是在A9–A14這些更靠近PAM的腺嘌呤堿基中（比普通ABE8e提高了7.98倍）,，且無靶序列偏好性,。其中，hyABE8e-SpRY表現最為突出,，在測試的靶點中（包含除上述NGN-PAM靶點外的12個NHN-PAM靶點）展現出較高的編輯活性（在7個靶點中表現出100%的編輯效率）,、幾乎無PAM限制的靶點識別能力、較廣的編輯窗口（A1–A13）,、較低的T-DNA自靶向突變率（在NGN-PAM靶點中為16.9%,，在NHN-PAM靶點中為11.9%）且不產生sgRNA依賴的脫靶效應。此外,，一種進化的sgRNA（esgRNA）被用作降低SpRYn引起的T-DNA自編輯效應,，但其似乎與PhieABE系統(tǒng)并不兼容。
該研究開發(fā)的PhieABEs編輯系統(tǒng)（特別是hyABE8e-SpRY）具有高效且?guī)缀鯚oPAM限制的靶點識別能力,，為水稻和其他植物（作物）的單堿基編輯提供了更為有效實用的工具,，有望能被廣泛地應用于基因功能研究、基因飽和突變,、引入或消除終止密碼子和可變剪接等研究中,。
博士后譚健韜和曾棟昌，博士生趙延昌為該論文的共同第一作者,，祝欽瀧研究員為通訊作者,，劉耀光院士參與了相關研究工作。該研究得到了廣東省基礎與應用基礎研究重大項目,、國家自然科學基金,、廣東特支計劃科技創(chuàng)新青年拔尖人才專項和中國博士后基金的資助。（文圖/生命科學學院）
