近日，我校生命科學(xué)學(xué)院、亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室劉耀光院士/祝欽瀧研究員團(tuán)隊(duì)在國際著名學(xué)術(shù)期刊Plant Biotechnology Journal（IF2020=9.803，生物學(xué)一區(qū)）在線發(fā)表了題為“PhieABEs: a PAM-less/free high-efficiency adenine base editor toolbox with wide target scope in plants”的研究論文（論文鏈接地址：https://doi.org/10.1111/pbi.13774）。該研究利用高活性腺嘌呤脫氨酶、單鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）與廣靶向的SpCas9變體，成功開發(fā)了一套幾乎無PAM限制的高效廣靶向植物腺嘌呤堿基編輯器PhieABEs （plant high-efficiency ABEs），為植物功能基因組研究和作物遺傳改良提供了實(shí)用的工具，并對其他編輯系統(tǒng)的改良具有參考意義。

通過將腺嘌呤或胞嘧啶脫氨酶與Cas9缺刻酶（Cas9n）融合而成的腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）和胞嘧啶堿基編輯器（CBEs）能在不需要供體模板且不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的條件下分別實(shí)現(xiàn)A-G（T-C）或C-T（G-A）的堿基替換。但是目前廣泛使用的ABE7.10系統(tǒng)在植物中的編輯效率很低（平均約為0-11.9%），而最近的研究中報(bào)道了基于新型腺嘌呤脫氨酶TadA8e開發(fā)的ABE8e系統(tǒng)在一定程度上提高了植物單堿基編輯效率，但仍缺乏在多個(gè)代表性靶點(diǎn)中對其穩(wěn)定性和靶序列偏好性進(jìn)行系統(tǒng)分析。另一方面，目前大多數(shù)堿基編輯系統(tǒng)使用識別NGG-PAM的SpCas9n變體，其嚴(yán)重限制了基因組靶點(diǎn)的選擇自由度。因此，開發(fā)更加高效、廣靶向的植物ABE系統(tǒng)，對促進(jìn)功能基因組研究、加快農(nóng)作物遺傳改良進(jìn)程具有重要作用與現(xiàn)實(shí)意義。

此外，來自人源Rad51蛋白非序列特異性的ssDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD），對解旋后的DNA單鏈具有穩(wěn)定作用，但其與植物ABE系統(tǒng)的兼容性如何，以及能否提高堿基編輯系統(tǒng)的活性并擴(kuò)增編輯窗口，均是未知的。

劉耀光院士/祝欽瀧研究員團(tuán)隊(duì)根據(jù)水稻密碼子偏好性重新優(yōu)化TadA8e、DBD的核苷酸序列，并將它們分別與兩種識別NGN-PAM（PAM-less）的SpCas9n變體編碼基因SpCas9n-NG和SpGn，以及一種識別NNN-PAM（PAM-free）的SpCas9n變體編碼基因SpRYn融合，開發(fā)了一套植物腺嘌呤單堿基編輯器PhieABEs（hyABE8e-NG、hyABE8e-SpG和hyABE8e-SpRY），并在29個(gè)水稻基因組靶點(diǎn)（含有NGN-PAM或NHN-PAM，其中H為A，T或C）中測試分析了上述系統(tǒng)的編輯效率等特性。結(jié)果顯示，在17個(gè)測試的NGN-PAM靶點(diǎn)中，PhieABEs的平均編輯效率為67.8%–78.5%，編輯窗口為A₁–A₁₄，相較于ABE7.10（平均效率為2.6%，編輯窗口為A₄–A₈）和普通ABE8e系統(tǒng)（平均效率為46.7%–59.7%，編輯窗口為A₃–A₁₄）均有顯著的提高和擴(kuò)展，特別是在A₉–A₁₄這些更靠近PAM的腺嘌呤堿基中（比普通ABE8e提高了7.98倍），且無靶序列偏好性。其中，hyABE8e-SpRY表現(xiàn)最為突出，在測試的靶點(diǎn)中（包含除上述NGN-PAM靶點(diǎn)外的12個(gè)NHN-PAM靶點(diǎn)）展現(xiàn)出較高的編輯活性（在7個(gè)靶點(diǎn)中表現(xiàn)出100%的編輯效率）、幾乎無PAM限制的靶點(diǎn)識別能力、較廣的編輯窗口（A₁–A₁₃）、較低的T-DNA自靶向突變率（在NGN-PAM靶點(diǎn)中為16.9%，在NHN-PAM靶點(diǎn)中為11.9%）且不產(chǎn)生sgRNA依賴的脫靶效應(yīng)。此外，一種進(jìn)化的sgRNA（esgRNA）被用作降低SpRYn引起的T-DNA自編輯效應(yīng)，但其似乎與PhieABE系統(tǒng)并不兼容。

該研究開發(fā)的PhieABEs編輯系統(tǒng)（特別是hyABE8e-SpRY）具有高效且?guī)缀鯚oPAM限制的靶點(diǎn)識別能力，為水稻和其他植物（作物）的單堿基編輯提供了更為有效實(shí)用的工具，有望能被廣泛地應(yīng)用于基因功能研究、基因飽和突變、引入或消除終止密碼子和可變剪接等研究中。

博士后譚健韜和曾棟昌，博士生趙延昌為該論文的共同第一作者，祝欽瀧研究員為通訊作者，劉耀光院士參與了相關(guān)研究工作。該研究得到了廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究重大項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金、廣東特支計(jì)劃科技創(chuàng)新青年拔尖人才專項(xiàng)和中國博士后基金的資助。（文圖/生命科學(xué)學(xué)院）