近日,，我校生命科學(xué)學(xué)院,、嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室、亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室劉耀光院士和陳樂天教授團隊在國際著名學(xué)術(shù)期刊Molecular Plant（IF2020=13.164，生物學(xué)一區(qū)）在線發(fā)表了題為“STI PCR: an efficient method for amplification and de novo synthesis of long DNA sequences”的研究論文（論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2021.12.018）,。該研究開發(fā)了一種適用于所有生物基因組的高效、特異地擴增超大片段DNA和體外大片段DNA合成的PCR新方法：抑制熱交錯PCR（Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR）,。
該PCR方法結(jié)合了兩方面的原理,。一是在正/反向特異引物的5’端引入一段相同的短序列（Tm = 68–72℃），使擴增片段的DNA鏈末端形成反向互補序列,。在使用較低的引物濃度下,，長度較短的非特異產(chǎn)物鏈（包括引物二聚體）的兩末端容易相互配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)而阻止引物的結(jié)合，使PCR擴增受到強烈的抑制（PCR Suppression, PS）,；而較大片段DNA鏈的兩末端之間距離遠,，難以相互配對而PS效應(yīng)較小，因此可以消除或減少非特異產(chǎn)物的競爭性擴增而強化目的大片段的特異性擴增,。二是在鏈延伸階段使用不同幅度（60–72℃）變溫的嵌套熱交錯內(nèi)循環(huán)（nested thermo-interlaced cycling, TIC）,，以優(yōu)化具有不同GC含量分布的目標DNA序列的鏈延伸效率，最終提高擴增效率,。這兩種因素的結(jié)合可以產(chǎn)生明顯的對長片段DNA擴增效率和特異性的倍加效應(yīng),。另外，該研究還開發(fā)了一個在線工具calGC（http://skl.scau.edu.cn/calGC/, or http://www.ygliulab.club/calGC/）,，用于分析目標DNA序列的GC分布特征,，并以此自動推薦一個合適的PCR熱循環(huán)程序。
STI PCR工作原理圖（A-C）及其在超長DNA片段擴增中的應(yīng)用（D-I）
為了比較不同PCR方法對DNA長片段擴增的性能,，該研究使用標準引物和抑制PCR引物,，并結(jié)合常規(guī)熱循環(huán)或嵌套熱交錯內(nèi)循環(huán)條件進行了四組PCR擴增。結(jié)果只有STI PCR可以從水稻,、玉米和人類細胞系等基因組中高特異性地擴增出從10 kb以上甚至30 kb以上（最高達38 kb）的各種長度的目標DNA片段,。表明抑制PCR和嵌套熱交錯內(nèi)循環(huán)這2個原理的結(jié)合產(chǎn)生了很強的擴增能力和特異性的疊加效應(yīng)。
目前,，體外DNA合成的主流方法是,，以化學(xué)合成覆蓋目標序列的重疊的寡核苷酸引物，再通過Polymerase Cycling Assembly（PCA）或overlapping PCR法將寡核苷酸引物進行目標DNA模板拼接、再進行常規(guī)PCR擴增,。但這種方法一次體外合成DNA片段的長度通常限制在約3 kb以內(nèi),。該研究利用modified PCA（mPCA）和STI PCR高效擴增目標序列，一次體外從頭正確的合成達7 kb的重組基因序列,。而且,，該研究還利用mPCA-STI PCR將4個DNA片段（7.0 kb, 4.3 kb, 7.8 kb和5.3 kb）成功地組裝為24.4 kb的連續(xù)片段。這些測試表明了STI PCR對大幅提升DNA合成和多片段組裝能力的重要作用,。
綜上,，該研究開發(fā)的STI PCR突破了當前PCR方法在擴增DNA片段大小和特異性方面的局限性，極大地提高了超大片段DNA擴增和DNA從頭合成及多片段組裝的能力,，可廣泛應(yīng)用于基因克隆,、功能分析、測序和基因組結(jié)構(gòu)變異檢測等研究,，是一種重要的技術(shù)進步,。而且，該calGC網(wǎng)站工具也有助于研究人員在日常的分子生物學(xué)研究中分析DNA序列的GC含量和分布特征,，這些技術(shù)將極大地推動分子生物學(xué),、合成生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展。
博士后趙哲,、團隊青年教師謝先榮和劉偉智為該論文的共同第一作者,，劉耀光院士和陳樂天教授為共同通訊作者。該研究得到了國家自然科學(xué)基金重大項目,、國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體項目,、廣州市科技計劃重點項目、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究重大項目和博士后科學(xué)基金面上項目的資助,。（文圖/生命科學(xué)學(xué)院）
