近日,，我校農(nóng)學(xué)院,、亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室、嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室劉耀光院士/祝欽瀧研究員團隊在國際著名學(xué)術(shù)期刊Plant Biotechnology Journal（影響因子11.6, 生物/工程技術(shù)1區(qū)）在線發(fā)表了題為“PhieDBEs: a DBD-containing, PAM-flexible, high-efficiency dual base editor toolbox with wide targeting scope for use in plants”的研究論文,。

　　該研究在前期開發(fā)的單堿基編輯器PhieCBEs和PhieABEs基礎(chǔ)上,，利用高活性胞嘧啶脫氨酶（evoFERNY）和腺嘌呤脫氨酶（TadA8e）,、單鏈DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）與廣靶向的SpCas9缺刻酶變體SpGn，成功開發(fā)了一套廣靶向的植物高效雙堿基編輯器PhieDBEs（plant high-efficiency dual base editors），進一步完善了植物基因編輯工具箱,。此外，通過不同組合方式將功能元件DBD融合在雙堿基編輯器不同位置,，探究了其最佳融合位置和拷貝數(shù),，為開發(fā)多元件多重功能的基因編輯工具提供了重要參考。

　　基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)的單堿基編輯器（BEs）能夠在不需要供體模板及不造成雙鏈DNA斷裂的條件下實現(xiàn)單堿基替換,，提高了基因編輯的精確性,，但由于實現(xiàn)的堿基替換類型過于單一，不利于內(nèi)源基因的快速馴化和目標基因的飽和突變篩選,。而將胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶同時融合到SpCas9缺刻酶（SpCas9n）所獲得的雙堿基編輯器（DBE）,，能夠同時實現(xiàn)A-to-G和C-to-T轉(zhuǎn)換，豐富靶位點的突變類型,，進一步擴大了堿基編輯的應(yīng)用范圍,。但其仍然存在SpCas9n靶向范圍窄（識別NGG-PAM）、雙堿基同步發(fā)生編輯的效率較低等問題,，限制了DBEs在植物中的廣泛應(yīng)用,。

　　為了克服DBEs目前存在的問題，該研究基于廣靶向的SpCas9n變體SpGn（識別NG-PAM）,，利用高活性胞苷脫氨酶evoFERNY和腺苷脫氨酶TadA8e,，以及人源RAD51 DBD的不同融合方式，構(gòu)建了由9個編輯器組成的一系列DBE-SpGn載體（圖1）,。在水稻中設(shè)計了48個NGN PAM的靶點對DBE-SpGn 的編輯效率進行系統(tǒng)性檢測,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SpGn的N端融合了單拷貝DBD的C-A-D-SpGn平均編輯效率最高達41.9%（2.4%~95.2%）比C-A-SpGn的平均編輯效率33.7%(2.1%~75.0%)顯著提高，表明當兩種脫氨酶和單拷貝DBD均位于SpGn的N端時能更有效地實現(xiàn)雙堿基編輯,。融合了雙拷貝DBD的C-D-SpGn-D-A和A-D-SpGn-D-C的平均編輯效率僅2.3%（0~14.9%）和10.8%（0~54.6%）,，這表明多拷貝的DBD并不能提高編輯效率，還會因功能元件較多而導(dǎo)致的空間位阻抑制了DBEs發(fā)揮有效功能,。此外,，將脫氨酶融合在C端則使其對應(yīng)產(chǎn)生的堿基脫氨頻率大幅度降低,，而融合在復(fù)合體N端時更有利于其發(fā)揮功能，說明脫氨酶也具有明顯的N端位置優(yōu)勢,。

圖1.雙堿基編輯器DBE-SpGn的結(jié)構(gòu)與編輯特征,。（A）DBE-SpGn的載體結(jié)構(gòu)圖；（B）C-A-D-SpGn的工作示意圖,；（C）DBE-SpGn分別在12個測試的水稻內(nèi)源靶點的編輯效率,；（D）各個載體在靶點范圍內(nèi)所產(chǎn)生的不同的堿基編輯產(chǎn)物。

　　從DBE-SpGn載體中篩選出能夠高效產(chǎn)生A-to-G＆C-to-T同步替換的一組雙堿基編輯器（C-A-SpGn,，C-A-D-SpGn和A-C-D-SpGn）,，將其命名為PhieDBEs。其中C-A-D-SpGn在靶點V2TS6-TGW6上編輯效率最高可達95.2%,，并且A-to-G＆C-to-T同時替換的概率最高達81.0%,。此外，PhieDBEs的C-to-T和A-to-G編輯窗口趨于一致,，主要口集中在M5-M9（M=A/C）,，C-A-SpGn和C-A-D-SpGn在主要窗口外的A3處也顯示較高的編輯活性（圖2）。與此前大部分研究報道的堿基編輯器相較而言,，PhieDBEs編輯窗口變窄,，更有利于進行精準編輯。最后,，該研究對PhieDBEs的多種編輯特性進行了分析,，結(jié)果表明能夠高效靶向NG PAM，并且在靶點內(nèi)對A或C的編輯都不存在明顯的序列背景偏好性,，使用一個載體能夠?qū)崿F(xiàn)多個靶點同時產(chǎn)生多種類型的堿基替換等優(yōu)點。

圖2. PhieDBEs在靶位點產(chǎn)生有效的雙堿基轉(zhuǎn)換,。（A）的編輯活性窗口,；（B）DBE-SpGn所產(chǎn)生的的突變類型比例；（C）DBE-SpGn在四種NGN-PAM靶位點的編輯效率,。

　　該研究通過兩個高活性脫氨酶和廣靶向的SpGn變體,，以及RAD51 DBD的組合，開發(fā)了一套植物高效廣靶向的雙堿基編輯系統(tǒng) PhieDBEs,，揭示了功能元件DBD的最優(yōu)融合條件及其對鄰近脫氨酶的影響,，以及脫氨酶自身具有的位置效應(yīng)，為開發(fā)多元件多重功能的堿基編輯器提供了重要參考,。PhieDBEs表現(xiàn)出比目前已報道的植物雙堿基編輯器更優(yōu)異的編輯活性和較窄的編輯窗口,，有利于實現(xiàn)更加準確的核苷酸替換和特定的氨基酸轉(zhuǎn)變，這將為植物功能突變體的篩選提供更多可選擇工具,，進一步完善了植物高效堿基編輯系統(tǒng)工具箱,。 

　　博士生鄭芷曄和劉濤利,，博士后柴楠為該論文的共同第一作者，祝欽瀧研究員與劉耀光院士為論文的共同通訊作者,。該研究得到了國家重點研發(fā)計劃項目,、國家自然科學(xué)基金項目、廣東省“十四五”農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新十大重點項目,、嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實驗室項目,、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究重大項目和廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項資金（“攀登計劃”專項資金）的資助。

　　相關(guān)論文信息：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14438

文圖/農(nóng)學(xué)院