近日,，我校生命科學(xué)學(xué)院,、亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室和嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室劉耀光院士/祝欽瀧研究員團隊在國際知名學(xué)術(shù)期刊Plant Biotechnology Journal（IF2021=13.263,，生物學(xué)/工程技術(shù)1區(qū)）在線發(fā)表了題為“Efficient assembly of long DNA fragments and multiple genes with improved nickase-based cloning and Cre/loxP recombination”的研究論文（論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13882）,，利用特異核苷酸序列引導(dǎo)的缺刻酶介導(dǎo)的DNA組裝與Cre/loxP重組相結(jié)合,，開發(fā)了一種新的簡單,、高效,、低成本的大片段DNA克隆與多基因疊加系統(tǒng)TGSII-UNiE,。 

　　功能基因組學(xué),、合成生物學(xué),、分子農(nóng)場的應(yīng)用、復(fù)雜性狀的遺傳改良以及代謝工程操作等,，都涉及到DNA大片段（LDNA）的克隆和多基因的組裝,。盡管目前已有多種DNA組裝技術(shù),，如Golden Gate克隆、重組酶系統(tǒng),、Gibson組裝等,，但仍然存在操作復(fù)雜、耗時費力且價格昂貴的問題,。因此,，開發(fā)一種簡單、高效,、低成本的DNA組裝方法十分必要,。缺刻酶（Nicking endonuclease，NiE）是一類能在DNA單鏈特定識別序列產(chǎn)生缺刻的限制性內(nèi)切酶,。當(dāng)其被設(shè)計到DNA片段末端時,，經(jīng)過酶切和變性時，就能產(chǎn)生單鏈突出末端,，已被用于缺刻酶介導(dǎo)的不依賴連接酶克?。∟iE-mediated ligation-independent cloning，NiE-LIC）,。NiE-LIC具有操作簡單和成本低的優(yōu)點,，但是由于其創(chuàng)制的單鏈突出末端較短（小于10個堿基（nt）），多片段組裝效率低,。為此,，該研究通過序列優(yōu)化設(shè)計得到了一系列15 nt的特異核苷酸序列（Unique nucleotide sequences，UNSs）,，并使用熱穩(wěn)定的Taq DNA 連接酶和采用變溫連接（thermo-cycle ligation）,，開發(fā)了更高效的特異核苷酸序列引導(dǎo)的缺刻酶介導(dǎo)的DNA組裝（UNS-guided NiE-mediated DNA assembly，UNiEDA）,。進一步將UNiEDA引入到作者之前開發(fā)的Cre/loxP介導(dǎo)的多基因疊加系統(tǒng)TGSII（TransGene Stacking II）中,，開發(fā)了一種新的簡單、高效,、低成本的大片段DNA克隆與多基因疊加系統(tǒng)TGSII-UNiE（圖1）,。

圖1  TGSII載體系統(tǒng).（a）UNiE克隆盒的序列特征；（b）含UNiE克隆盒的pCAMBIA骨架的雙元載體,；（c）含UNiE克隆盒的TAC骨架的雙元接受載體,；（d和e）含UNiE克隆盒的多基因供給載體

　　對不同長度的DNA大片段（10.3 kb、14.8 kb和22.9 kb）的克隆測試結(jié)果表明,，UNiEDA能高效的克隆不同長度的DNA大片段，且其克隆效率與采用試劑盒的Gibson組裝方法相似,，價格更低,。載體與DNA大片段的摩爾比為1:3時,，UNiEDA的效率最高；對于相同的DNA大片段,，雙元接受載體pYLTAC380H-UNiE的克隆效率高于pYL1300H-UNiE,。對4個2.5 kb左右的DNA片段組裝效率測試也表明，UNiEDA與Gibson組裝方法具有相似的多DNA片段組裝效率,，且更經(jīng)濟,。進一步，選用便于觀察的紅色甜菜紅素與綠色熒光作為易檢測的可視化marker,，用UNiEDA直接在雙元接受載體（pYL1300H-UNiE和pYLTAC380H-UNiE）上成功組裝了含5個基因（均采用P35s啟動子與Tnos終止子表達盒）的多基因載體（包括合成甜菜紅素的四個基因BvCYP76AD1S, BvDODA1S, cDOPA5GT 和 ADH與一個綠色熒光蛋白基因eGFP）pYL1300H-CDGAeG和pYLTAC380H-CDGAeG,，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，在本氏煙草葉片瞬時表達,，以及穩(wěn)定的***水稻愈傷與植株中,，均能觀察到甜菜紅素的合成與綠色熒光，證明了UNiEDA能有效的組裝含重復(fù)序列的多個DNA片段,，構(gòu)建的多基因載體是有功能的（圖2）,。對于少數(shù)基因（1-5個，或總長在12-15 kb以內(nèi)）的組裝,，不需要重組反應(yīng),，可直接利用UNiEDA在雙元載體或雙元接受載體上完成多基因組裝。此外,，利用上述結(jié)構(gòu),，該研究探討了相同啟動子重復(fù)使用的問題，發(fā)現(xiàn)當(dāng)重復(fù)使用P35S啟動子超過5次時（結(jié)構(gòu)pYL1300H-CDGeG和pYL1300H-CDGAeG）,，甜菜紅素在多數(shù)***水稻愈傷組織和植株中不能正常合成,，表明可能發(fā)生了同源啟動子引起的***表達沉默，以及同源重組刪除導(dǎo)致的***結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性,。因此相同啟動子重復(fù)使用時,，建議最多不超過4次。

圖2 甜菜紅素在***水稻中的合成,。（a）四個多基因載體（pYL1300H-eG, pYL1300H-CDeG, pYL1300H-CDGeG and pYL1300H-CDGAeG）獲得的***水稻愈傷表型,；（b）pYL1300H-CDGAeG獲得***水稻植株表型：Red ~ red表示從紅色愈傷組織分化獲得的紅色轉(zhuǎn)化植株；Green ~ red表示從紅色愈傷組織分化獲得的綠色轉(zhuǎn)化植株（無甜菜紅素合成）,；Green ~ pale-yellow表示從淡黃色愈傷組織分化獲得的綠色植株（無甜菜紅素合成）,；（c-g）***水稻植株外源基因的qRT-PCR分析

　　為測試更多基因的組裝能力，該研究在合成甜菜紅素的基礎(chǔ)上,，進一步在多基因供給載體上分別組裝了與抗病相關(guān)的單子葉植物特有的脂肪族酚胺-羥基肉桂酰腐胺(HP)基因簇的3個基因（OsODC, OsPHT3 和OsPHT4）,，以及與氮代謝利用相關(guān)的3個谷氨酰胺合成酶基因（OsGS1;1, OsGS1;2 和 OsGS1;3），通過2輪簡單的Cre/loxP重組，構(gòu)建完成了含有12個基因（包括HPT篩選標(biāo)記基因）T-DNA區(qū)約40 kb的多基因雙元載體pYLTAC380H-GSs/HPs/CDGAeG（圖3）,。上述結(jié)果表明,，在組裝更多基因時，TGSII-UNiE系統(tǒng)更具有優(yōu)勢：利用UNiEDA在雙元接受載體與多基因供給載體上,，可同時平行進行多基因組裝,，最后只需1-2輪的Cre/loxP重組，就能完成更多基因與合成途徑的組裝,。

圖3 TGSII-UNiE系統(tǒng)對多基因的高效組裝,。（a）利用UNiEDA方法分別在多基因供給載體上一步組裝HP基因簇的3個基因（OsODC, OsPHT3 和OsPHT4）與谷氨酰胺合成酶的3個基因（OsGS1;1, OsGS1;2 和 OsGS1;3），再通過兩輪簡單的Cre/loxP重組,，組裝上述多個基因到含5個基因的雙元接受載體,，獲得含12個基因的多基因雙元載體pYLTAC380H-GSs/HPs/CDGAeG；（b）多基因供給載體的酶切檢測,；（c）多基因雙元載體的酶切檢測與在農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性檢測

　　綜上,， 該研究開發(fā)的TGSII-UNiE 系統(tǒng)，具有設(shè)計簡單,、操作方便,、高效、省時,、成本低等優(yōu)點,，可有效克隆長 DNA 片段并快速組裝多個基因，在合成生物學(xué)與代謝工程等研究領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景,。劉耀光院士團隊祝欽瀧研究員課題組長期致力于植物合成生物學(xué),、基因編輯和基因工程共性技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用研究，已在Plant Biotechnology Journal發(fā)表了多研究論文,，如開發(fā)了高效廣靶向植物腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)PhieABEs（DOI: 10.1111/pbi.13774）,、高效的模塊化熒光融合蛋白工具箱AioFFP（DOI: 10.1111/pbi.13790）和高效的多基因疊加新系統(tǒng)TGSII-UNiE（DOI: 10.1111/pbi.13882），為植物功能基因組學(xué),、合成生物學(xué),、代謝工程和作物遺傳改良等方面的研究提供能了實用工具與強有力的技術(shù)支撐。

　　生命科學(xué)學(xué)院博士生趙延昌,，博士后韓靖鸞和譚健韜,，碩士生楊雅茜為論文的共同第一作者，祝欽瀧研究員與劉耀光院士為論文的共同通訊作者,。該研究得到了嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室項目,、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究重大項目、國家自然科學(xué)基金和廣東特支計劃科技創(chuàng)新青年拔尖人才專項的資助,。

文圖/生命科學(xué)學(xué)院