近日,，我校生命科學(xué)學(xué)院,、嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室,、亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉耀光院士和陳樂(lè)天教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Molecular Plant（IF2020=13.164,，生物學(xué)一區(qū)）在線發(fā)表了題為“STI PCR: an efficient method for amplification and de novo synthesis of long DNA sequences”的研究論文（論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2021.12.018）,。該研究開(kāi)發(fā)了一種適用于所有生物基因組的高效,、特異地?cái)U(kuò)增超大片段DNA和體外大片段DNA合成的PCR新方法：抑制熱交錯(cuò)PCR（Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR）,。
該P(yáng)CR方法結(jié)合了兩方面的原理,。一是在正/反向特異引物的5’端引入一段相同的短序列（Tm = 68–72℃）,，使擴(kuò)增片段的DNA鏈末端形成反向互補(bǔ)序列,。在使用較低的引物濃度下，長(zhǎng)度較短的非特異產(chǎn)物鏈（包括引物二聚體）的兩末端容易相互配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)而阻止引物的結(jié)合,，使PCR擴(kuò)增受到強(qiáng)烈的抑制（PCR Suppression, PS）,；而較大片段DNA鏈的兩末端之間距離遠(yuǎn)，難以相互配對(duì)而PS效應(yīng)較小,，因此可以消除或減少非特異產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增而強(qiáng)化目的大片段的特異性擴(kuò)增,。二是在鏈延伸階段使用不同幅度（60–72℃）變溫的嵌套熱交錯(cuò)內(nèi)循環(huán)（nested thermo-interlaced cycling, TIC），以優(yōu)化具有不同GC含量分布的目標(biāo)DNA序列的鏈延伸效率,，最終提高擴(kuò)增效率,。這兩種因素的結(jié)合可以產(chǎn)生明顯的對(duì)長(zhǎng)片段DNA擴(kuò)增效率和特異性的倍加效應(yīng),。另外，該研究還開(kāi)發(fā)了一個(gè)在線工具calGC（http://skl.scau.edu.cn/calGC/, or http://www.ygliulab.club/calGC/）,，用于分析目標(biāo)DNA序列的GC分布特征,，并以此自動(dòng)推薦一個(gè)合適的PCR熱循環(huán)程序。
STI PCR工作原理圖（A-C）及其在超長(zhǎng)DNA片段擴(kuò)增中的應(yīng)用（D-I）
為了比較不同PCR方法對(duì)DNA長(zhǎng)片段擴(kuò)增的性能,，該研究使用標(biāo)準(zhǔn)引物和抑制PCR引物,，并結(jié)合常規(guī)熱循環(huán)或嵌套熱交錯(cuò)內(nèi)循環(huán)條件進(jìn)行了四組PCR擴(kuò)增。結(jié)果只有STI PCR可以從水稻,、玉米和人類細(xì)胞系等基因組中高特異性地?cái)U(kuò)增出從10 kb以上甚至30 kb以上（最高達(dá)38 kb）的各種長(zhǎng)度的目標(biāo)DNA片段,。表明抑制PCR和嵌套熱交錯(cuò)內(nèi)循環(huán)這2個(gè)原理的結(jié)合產(chǎn)生了很強(qiáng)的擴(kuò)增能力和特異性的疊加效應(yīng)。
目前,，體外DNA合成的主流方法是,，以化學(xué)合成覆蓋目標(biāo)序列的重疊的寡核苷酸引物，再通過(guò)Polymerase Cycling Assembly（PCA）或overlapping PCR法將寡核苷酸引物進(jìn)行目標(biāo)DNA模板拼接,、再進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增,。但這種方法一次體外合成DNA片段的長(zhǎng)度通常限制在約3 kb以內(nèi)。該研究利用modified PCA（mPCA）和STI PCR高效擴(kuò)增目標(biāo)序列,，一次體外從頭正確的合成達(dá)7 kb的重組基因序列,。而且，該研究還利用mPCA-STI PCR將4個(gè)DNA片段（7.0 kb, 4.3 kb, 7.8 kb和5.3 kb）成功地組裝為24.4 kb的連續(xù)片段,。這些測(cè)試表明了STI PCR對(duì)大幅提升DNA合成和多片段組裝能力的重要作用,。
綜上，該研究開(kāi)發(fā)的STI PCR突破了當(dāng)前PCR方法在擴(kuò)增DNA片段大小和特異性方面的局限性,，極大地提高了超大片段DNA擴(kuò)增和DNA從頭合成及多片段組裝的能力,，可廣泛應(yīng)用于基因克隆、功能分析,、測(cè)序和基因組結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)等研究,，是一種重要的技術(shù)進(jìn)步。而且,，該calGC網(wǎng)站工具也有助于研究人員在日常的分子生物學(xué)研究中分析DNA序列的GC含量和分布特征,，這些技術(shù)將極大地推動(dòng)分子生物學(xué)、合成生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展,。
博士后趙哲,、團(tuán)隊(duì)青年教師謝先榮和劉偉智為該論文的共同第一作者，劉耀光院士和陳樂(lè)天教授為共同通訊作者,。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目,、國(guó)家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體項(xiàng)目、廣州市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目,、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究重大項(xiàng)目和博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目的資助,。（文圖/生命科學(xué)學(xué)院）
