近日，我校生命科學(xué)學(xué)院、亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室劉耀光院士/祝欽瀧研究員團(tuán)隊(duì)在國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊Plant Biotechnology Journal（IF2021=13.263，生物學(xué)/工程技術(shù)1區(qū)）在線發(fā)表了題為“Efficient assembly of long DNA fragments and multiple genes with improved nickase-based cloning and Cre/loxP recombination”的研究論文（論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13882），利用特異核苷酸序列引導(dǎo)的缺刻酶介導(dǎo)的DNA組裝與Cre/loxP重組相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種新的簡(jiǎn)單、高效、低成本的大片段DNA克隆與多基因疊加系統(tǒng)TGSII-UNiE。 

　　功能基因組學(xué)、合成生物學(xué)、分子農(nóng)場(chǎng)的應(yīng)用、復(fù)雜性狀的遺傳改良以及代謝工程操作等，都涉及到DNA大片段（LDNA）的克隆和多基因的組裝。盡管目前已有多種DNA組裝技術(shù)，如Golden Gate克隆、重組酶系統(tǒng)、Gibson組裝等，但仍然存在操作復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力且價(jià)格昂貴的問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、高效、低成本的DNA組裝方法十分必要。缺刻酶（Nicking endonuclease，NiE）是一類能在DNA單鏈特定識(shí)別序列產(chǎn)生缺刻的限制性內(nèi)切酶。當(dāng)其被設(shè)計(jì)到DNA片段末端時(shí)，經(jīng)過(guò)酶切和變性時(shí)，就能產(chǎn)生單鏈突出末端，已被用于缺刻酶介導(dǎo)的不依賴連接酶克隆（NiE-mediated ligation-independent cloning，NiE-LIC）。NiE-LIC具有操作簡(jiǎn)單和成本低的優(yōu)點(diǎn)，但是由于其創(chuàng)制的單鏈突出末端較短（小于10個(gè)堿基（nt）），多片段組裝效率低。為此，該研究通過(guò)序列優(yōu)化設(shè)計(jì)得到了一系列15 nt的特異核苷酸序列（Unique nucleotide sequences，UNSs），并使用熱穩(wěn)定的Taq DNA 連接酶和采用變溫連接（thermo-cycle ligation），開(kāi)發(fā)了更高效的特異核苷酸序列引導(dǎo)的缺刻酶介導(dǎo)的DNA組裝（UNS-guided NiE-mediated DNA assembly，UNiEDA）。進(jìn)一步將UNiEDA引入到作者之前開(kāi)發(fā)的Cre/loxP介導(dǎo)的多基因疊加系統(tǒng)TGSII（TransGene Stacking II）中，開(kāi)發(fā)了一種新的簡(jiǎn)單、高效、低成本的大片段DNA克隆與多基因疊加系統(tǒng)TGSII-UNiE（圖1）。

圖1  TGSII載體系統(tǒng).（a）UNiE克隆盒的序列特征；（b）含UNiE克隆盒的pCAMBIA骨架的雙元載體；（c）含UNiE克隆盒的TAC骨架的雙元接受載體；（d和e）含UNiE克隆盒的多基因供給載體

　　對(duì)不同長(zhǎng)度的DNA大片段（10.3 kb、14.8 kb和22.9 kb）的克隆測(cè)試結(jié)果表明，UNiEDA能高效的克隆不同長(zhǎng)度的DNA大片段，且其克隆效率與采用試劑盒的Gibson組裝方法相似，價(jià)格更低。載體與DNA大片段的摩爾比為1:3時(shí)，UNiEDA的效率最高；對(duì)于相同的DNA大片段，雙元接受載體pYLTAC380H-UNiE的克隆效率高于pYL1300H-UNiE。對(duì)4個(gè)2.5 kb左右的DNA片段組裝效率測(cè)試也表明，UNiEDA與Gibson組裝方法具有相似的多DNA片段組裝效率，且更經(jīng)濟(jì)。進(jìn)一步，選用便于觀察的紅色甜菜紅素與綠色熒光作為易檢測(cè)的可視化marker，用UNiEDA直接在雙元接受載體（pYL1300H-UNiE和pYLTAC380H-UNiE）上成功組裝了含5個(gè)基因（均采用P35s啟動(dòng)子與Tnos終止子表達(dá)盒）的多基因載體（包括合成甜菜紅素的四個(gè)基因BvCYP76AD1S, BvDODA1S, cDOPA5GT 和 ADH與一個(gè)綠色熒光蛋白基因eGFP）pYL1300H-CDGAeG和pYLTAC380H-CDGAeG，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，在本氏煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)，以及穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因水稻愈傷與植株中，均能觀察到甜菜紅素的合成與綠色熒光，證明了UNiEDA能有效的組裝含重復(fù)序列的多個(gè)DNA片段，構(gòu)建的多基因載體是有功能的（圖2）。對(duì)于少數(shù)基因（1-5個(gè)，或總長(zhǎng)在12-15 kb以內(nèi)）的組裝，不需要重組反應(yīng)，可直接利用UNiEDA在雙元載體或雙元接受載體上完成多基因組裝。此外，利用上述結(jié)構(gòu)，該研究探討了相同啟動(dòng)子重復(fù)使用的問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)當(dāng)重復(fù)使用P35S啟動(dòng)子超過(guò)5次時(shí)（結(jié)構(gòu)pYL1300H-CDGeG和pYL1300H-CDGAeG），甜菜紅素在多數(shù)轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織和植株中不能正常合成，表明可能發(fā)生了同源啟動(dòng)子引起的轉(zhuǎn)基因表達(dá)沉默，以及同源重組刪除導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。因此相同啟動(dòng)子重復(fù)使用時(shí)，建議最多不超過(guò)4次。

圖2 甜菜紅素在轉(zhuǎn)基因水稻中的合成。（a）四個(gè)多基因載體（pYL1300H-eG, pYL1300H-CDeG, pYL1300H-CDGeG and pYL1300H-CDGAeG）獲得的轉(zhuǎn)基因水稻愈傷表型；（b）pYL1300H-CDGAeG獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株表型：Red ~ red表示從紅色愈傷組織分化獲得的紅色轉(zhuǎn)化植株；Green ~ red表示從紅色愈傷組織分化獲得的綠色轉(zhuǎn)化植株（無(wú)甜菜紅素合成）；Green ~ pale-yellow表示從淡黃色愈傷組織分化獲得的綠色植株（無(wú)甜菜紅素合成）；（c-g）轉(zhuǎn)基因水稻植株外源基因的qRT-PCR分析

　　為測(cè)試更多基因的組裝能力，該研究在合成甜菜紅素的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在多基因供給載體上分別組裝了與抗病相關(guān)的單子葉植物特有的脂肪族酚胺-羥基肉桂酰腐胺(HP)基因簇的3個(gè)基因（OsODC, OsPHT3 和OsPHT4），以及與氮代謝利用相關(guān)的3個(gè)谷氨酰胺合成酶基因（OsGS1;1, OsGS1;2 和 OsGS1;3），通過(guò)2輪簡(jiǎn)單的Cre/loxP重組，構(gòu)建完成了含有12個(gè)基因（包括HPT篩選標(biāo)記基因）T-DNA區(qū)約40 kb的多基因雙元載體pYLTAC380H-GSs/HPs/CDGAeG（圖3）。上述結(jié)果表明，在組裝更多基因時(shí)，TGSII-UNiE系統(tǒng)更具有優(yōu)勢(shì)：利用UNiEDA在雙元接受載體與多基因供給載體上，可同時(shí)平行進(jìn)行多基因組裝，最后只需1-2輪的Cre/loxP重組，就能完成更多基因與合成途徑的組裝。

圖3 TGSII-UNiE系統(tǒng)對(duì)多基因的高效組裝。（a）利用UNiEDA方法分別在多基因供給載體上一步組裝HP基因簇的3個(gè)基因（OsODC, OsPHT3 和OsPHT4）與谷氨酰胺合成酶的3個(gè)基因（OsGS1;1, OsGS1;2 和 OsGS1;3），再通過(guò)兩輪簡(jiǎn)單的Cre/loxP重組，組裝上述多個(gè)基因到含5個(gè)基因的雙元接受載體，獲得含12個(gè)基因的多基因雙元載體pYLTAC380H-GSs/HPs/CDGAeG；（b）多基因供給載體的酶切檢測(cè)；（c）多基因雙元載體的酶切檢測(cè)與在農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性檢測(cè)

　　綜上， 該研究開(kāi)發(fā)的TGSII-UNiE 系統(tǒng)，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便、高效、省時(shí)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可有效克隆長(zhǎng) DNA 片段并快速組裝多個(gè)基因，在合成生物學(xué)與代謝工程等研究領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景。劉耀光院士團(tuán)隊(duì)祝欽瀧研究員課題組長(zhǎng)期致力于植物合成生物學(xué)、基因編輯和基因工程共性技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究，已在Plant Biotechnology Journal發(fā)表了多研究論文，如開(kāi)發(fā)了高效廣靶向植物腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)PhieABEs（DOI: 10.1111/pbi.13774）、高效的模塊化熒光融合蛋白工具箱AioFFP（DOI: 10.1111/pbi.13790）和高效的多基因疊加新系統(tǒng)TGSII-UNiE（DOI: 10.1111/pbi.13882），為植物功能基因組學(xué)、合成生物學(xué)、代謝工程和作物遺傳改良等方面的研究提供能了實(shí)用工具與強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

　　生命科學(xué)學(xué)院博士生趙延昌，博士后韓靖鸞和譚健韜，碩士生楊雅茜為論文的共同第一作者，祝欽瀧研究員與劉耀光院士為論文的共同通訊作者。該研究得到了嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究重大項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金和廣東特支計(jì)劃科技創(chuàng)新青年拔尖人才專項(xiàng)的資助。

文圖/生命科學(xué)學(xué)院