近日,，我校生命科學(xué)學(xué)院,、亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室祝欽瀧研究員團(tuán)隊(duì)在國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊Plant Biotechnology Journal（IF2020=9.803，生物學(xué)/工程技術(shù)1區(qū)）在線發(fā)表了題為“All-in-one: A Robust Fluorescent Fusion Protein Vector Toolbox for Protein Localization and BiFC Analyses in Plants”的研究論文（論文鏈接：https://doi.org/10.1111/pbi.13790）,。該研究開發(fā)了一套基于特異核酸序列引導(dǎo)Gibson組裝介導(dǎo)的模塊化載體工具箱AioFFP（All-in-one Fluorescent Fusion Protein Vector Toolbox）,，用于高通量分析植物蛋白亞細(xì)胞定位和蛋白體內(nèi)相互作用,。
基于熒光蛋白標(biāo)記的蛋白定位（FTPL）和雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）技術(shù)是在植物體內(nèi)分析蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位和蛋白間相互作用的常用工具,。相比于以往使用的多個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化相比，將多個(gè)表達(dá)盒組裝于單一質(zhì)粒上進(jìn)行轉(zhuǎn)化能夠提高不同融合蛋白的共表達(dá)效率,。該模塊化AioFFP載體工具箱利用特異核苷酸序列引導(dǎo)的高效Gibson組裝反應(yīng)（一種不依賴限制性內(nèi)切酶的DNA連接方法,，可使用購買的試劑盒或自配試劑盒），可實(shí)現(xiàn)將不同熒光標(biāo)記蛋白的功能模塊進(jìn)行高效靈活組裝,。其包括了一套基于mChe熒光蛋白的亞細(xì)胞器標(biāo)記蛋白質(zhì)粒（12個(gè)）,、基于eGFP和eCFP及mChe的FTPL載體（6個(gè)）、基于Vn和Vc的BiFC載體（4個(gè)）以及2個(gè)雙元接受載體,，如下圖1所示,。
圖1 AioFFP載體工具箱組成與原理示意圖：（a）不同的功能模塊組成；（b）目的基因高效插入不同熒光融合蛋白質(zhì)粒,；（c）多個(gè)目的基因高通量插入1個(gè)目標(biāo)熒光融合蛋白質(zhì)粒,；（d）多個(gè)熒光蛋白表達(dá)盒一步組裝到瞬時(shí)表達(dá)載體；（e）多個(gè)熒光蛋白表達(dá)盒一步整合到雙元表達(dá)載體,。Ua~Uf為不同的Gibson連接特異位點(diǎn),。
利用不同載體上的相同特異性核苷酸片段，通過特異核苷酸序列引導(dǎo)的高效的DNA組裝技術(shù)Gibson assembly可在單管反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)：（1）將目的基因克隆到不同的FFP載體中,；（2）將多個(gè)目的基因插入到相同的FFP載體中,；（3）將細(xì)胞器標(biāo)記基因或不同熒光蛋白融合的靶基因表達(dá)盒組裝到同一個(gè)瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒；（4）將在瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒上的多個(gè)熒光蛋白融合基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到雙元載體上（如下圖2）,。該AioFFP載體工具箱操作簡(jiǎn)便,，效率高且成本低，在高通量分析植物蛋白亞細(xì)胞定位和蛋白將相互作用中具有很好的應(yīng)用潛力,，將有力的促進(jìn)植物功能基因組學(xué)的研究,。
圖2 多個(gè)熒光蛋白融合的表達(dá)模塊通過高效Gibson assembly（GA）反應(yīng)或多基因疊加系統(tǒng)（TGSII）的Cre/loxP重組技術(shù)組裝至雙元載體上，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙草葉片的瞬時(shí)表達(dá),。
生命科學(xué)學(xué)院博士后韓靖鸞和馬坤,、亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李華麗老師、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蘇菁副研究員為該論文的共同第一作者,，祝欽瀧研究員為論文的通訊作者,。劉耀光院士、陳樂天教授對(duì)該研究工作給予了指導(dǎo),。該研究得到了廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究重大項(xiàng)目,、國(guó)家自然科學(xué)基金、廣東特支計(jì)劃科技創(chuàng)新青年拔尖人才專項(xiàng),、廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目,、中國(guó)博士后基金的資助。 （文圖/生命科學(xué)學(xué)院）
